Carrera Ingeniería Bioquímica
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Item Prospección de la enzima PETasa de Ideonella sakaiensis(Universidad Técnica de Ambato. Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos y Biotecnología. Carrera de Ingeniería Bioquímica, 2022-09) Manzano Rivera, Ruth Abigail; García Solís, Mario DanielPlastic is one of the most used materials worldwide, its use has been around for a long time because its composition is very resistant and malleable to be able to develop many necessary tools and products. One of the best-known plastics is PET, which tends to be very resistant when wanting to degrade it. Many types of degradation have been used such as chemical, physicochemical, and biological. However, it has great limitations by resorting to polluting reagents, exaggerated temperatures and poor handling of the waste that causes degradation. One of the enzymes that degrade PET IsPETase from the bacterium Ideonella sakaiensis. The action of different mutants and variants that increased from 1.4 to 120 times the activity of the enzyme was described, the crystal structures of their mutants were also shown with an image resolution ranging from 1.4 to 2.00 angstrom, the crystal structures were found in the PDB, each residue presented a suitable polarity to the degradation of the PET surface. The double mutant with the highest Tm value was W159H, F229Y with a degradation rate equivalent to 23.4 mg of PET per hour, per milligram of enzyme. The adjuvants found were adequate to measure the kinetic rate of product formation and the binding of the substrate to the active site, the binding of SDS and dodecyl trimethylammonium helped the substrate to enter more easily into the active site of the enzyme.Item Análisis estructural de la enzima PETasa de Ideonella sakaiensis y enzimas homólogas(Universidad Técnica de Ambato. Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos y Biotecnología. Carrera de Ingeniería Bioquímica, 2022-03) Aguirre Muñoz, Adriana Alexandra; García Solís, Mario DanielPolyethylene terephthalate (PET), a low-cost thermoplastic produced industrially from fossil raw materials, is massively used in industry, and has become a high-impact pollutant. Among the latest discoveries related to the enzymatic treatment of PET is PETase from I. sakaiensis (IsPETase), which is a hydrolase capable of degrading PET. The present work was elaborated to establish possible mutations and modifications that improve the catalytic activity and enzymatic stability of IsPETase, for which a structural analysis of the same was carried out. Using the UNIPROT and PDBeFOLD databases, the enzymes that share a high degree of homology with IsPETase were identified. From these results, an analysis was carried out based on their percentage of sequence identity and secondary structure identity (SEQ and SSE respectively), E-value, Score, RMSD, and Q. The enzymes of greatest interest were selected for this analysis, the main ones being PbLipaseT, RgPETase, BbHydrolase, and SvCUT190, establishing that the N212S mutation can be used to improve the enzymatic activity and stability, in addition, possible substitutions to be studied were described to evaluate the effect that these would cause in the enzyme (S188E, S188A, and S114H). In the analysis of mutant variants, the presence of different amino acids in each case was identified; therefore, different possible substitutions to be made in the IsPETase enzyme were proposed, among the most relevant ones are W159F and S238T.Item Análisis Filogenético de Estructura y Genoma de enzima PETasa de Ideonella sakaiensis(Universidad Técnica de Ambato. Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos y Biotecnología. Carrera de Ingeniería Bioquímica, 2021-01) Garcés Cifuentes, Andrés Benjamín; Terán Mera, David AndrésThe bioinformatic studies presented on this work consisted of phylogenetic analysis, structure modeling and molecular docking. On the phylogenetic analysis, more than a hundred identified sequences like PETase from Ideonella sakaiensis were aligned with it. Said information was used to identify high homology sequences that codify for enzymes with possible PET hydrolytic activity. Through this procedure three enzymes were found that meet similar features. The enzyme Pbs from Acidovorax delafieldii (PbsA), DHL from Rizhobacter gummiphilus and DHL from Polyangium brachysporum. Protein structure modelling was performed using SWISSPROT. This needed since the three enzymes did not possess a crystallographic model present on any database. The templates used for the modelling reported are solution higher than 1.8 Armstroms. The molecular docking procedure was performed through AutodockTools. A PET monomer was used as ligand. As result the fixation energies of each enzyme were determined through enzymatic kinetics calculations. This value is a good indicator of substrateenzyme affinity. Finally, plasmid extraction, cell transformation and qualitative analysis of enzymatic activity was carried out in the E. coli (rosetta) cell line. The importance of this study lies in the discovery of PETase activity in already known proteins, which offers more biotechnological options for the treatment of plastic waste, which is an environmental problem that has progressively become a priority worldwide.Item Extracción, concentración y cuantificación de la actividad enzimática de la papaína a partir de la papaya (carica papaya)(Universidad Técnica de Ambato. Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos. Carrera de Ingeniería Bioquímica, 2011) Villavicencio Marcial, María Cristina; Alvarado, Juan de DiosLa papaya es una fruta tropical de gran demanda a nivel mundial ya que de este fruto se obtienen varios beneficios al consumirla, como a nivel industrial. En el campo de la Biotecnología en los últimos años se han realizado investigaciones sobre este fruto especialmente de la extracción de su látex que contiene varias enzimas, una de ellas es la papaína que tiene varias aplicaciones especialmente de uso comercial. Para este estudio se probó el efecto de 3 grados de maduración de la papaya: verde, pintona y madura; y su efecto en la actividad enzimática de la enzima papaína. Se trabajó con 10 papayas como fuente de análisis para cada uno de los tres grados de maduración de la fruta, se recolectó el látex extraído de estas 10 papayas y se procedió al proceso de concentración; posteriormente se obtiene un concentrado en polvo donde se encuentra la enzima. Con este concentrado se realizaron las pruebas de viscosidad en leche para las dos observaciones que se evaluaron. Por tanto se trabajó con tres grados de maduración de la papaya (verde, pintona y madura) cada uno por duplicado, dando un total de seis muestras. Se seleccionó la fruta para los tres grados de maduración, para la extracción del látex se realiza pequeñas incisiones a la piel de los frutos hasta obtener una leche blanquecina, recogerla y secarla en una incubadora a 40oC por 3 a 4 horas y media, dependiendo la cantidad de látex extraído; de esta manera se logra concentrar la enzima y se la conserva en congelación. La evaluación de la actividad enzimática se efectuó mediante determinaciones de viscosidad de leche obtenida por disolución de leche en polvo añadida a la misma 10ml de la solución de 0,1g de la enzima disuelta en 100ml de ácido acético; con estos valores de viscosidad se realizaron curvas de Tiempo (s) vs. Viscosidad (mPa*s), en los que se realizó una regresión exponencial obteniendo las respuestas experimentales que fueron los valores de corte con el eje y. En el análisis estadístico efectuado se demuestra que la mejor muestra es la P1 que corresponde a papayas verdes, es decir, que tiene mayor actividad enzimática con relación a los otros grados de maduración de papayaItem Obtención de un concentrado con bromelina a partir de piña (Ananas comosus), y determinación de su actividad enzimática en sustratos proteínicos.(Universidad Técnica de Ambato. Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos. Carrera de Ingeniería Bioquímica, 2012) Dalgo Flores, Violeta Maricela; Alvarado, Juan de DiosEn esta investigación se efectuó el estudio de la actividad enzimática de un concentrado de bromelina a partir de piña (Ananas comosus) en dos sustratos proteínicos de hidrólisis, leche y jugo de carne. El Ecuador al ser un país muy diverso en frutas y aplicando la Biotecnología se podría extraer enzimas presentes en dichos materiales. La bromelina es una enzima que se extrae del jugo de piña, y que presenta varias aplicaciones. En el proyecto de investigación se realizó la extracción y concentración de la proteasa de la piña y la determinación de su actividad enzimática en sustratos proteínicos, ya que se conoce que esta enzima presenta varias aplicaciones en la industria alimenticia, farmacéutica y en la medicina. Se utilizó como materia prima piñas de la variedad milagreña, en estado de maduración verde, porque se conoce que en ese estado las enzimas tienen mayor actividad sobre el sustrato. El jugo de piña fue extraído de la pulpa, y fue sometido a un proceso de precipitación de proteínas mediante precipitación alcohólica y salina, utilizando etanol al 96% y NaCl al 10% respectivamente. Posteriormente se realizó el proceso de concentrado de las muestras extracto-etanol y extracto-NaCl mediante el método de secado en estufa. Para determinar la actividad enzimática del concentrado de bromelina sobre el sustrato, se basó en el método de coagulación de la leche propuesto por Balls y Hoover, el mismo que fue validado al medirla variación de viscosidad de las muestras de leche con adición del concentrado de bromelina, utilizando el viscosímetro de Cannon –Fenske. Se quiso utilizar otro sustrato para comprobar la acción del concentrado de bromelina, y se utilizó jugo de carne, su obtención se realizó mediante un método propuesto por la investigadora. De la misma manera que para el sustrato leche, se determinó la variación de la viscosidad del jugo de carne al adicionar 0,1g de concentrado de bromelina disuelto en 100ml de vinagre natural. Se realizó entonces una adaptación del método de coagulación de la leche al jugo de carne, en donde también se observó que su viscosidad va aumentando conforme aumenta el tiempo de acción del concentrado de bromelina, demostrando que se da la hidrólisis de enlaces peptídicos de sus proteínas como son caseína y actina respectivamente. Los resultados indicaron que el etanol permite una mayor precipitación de proteínas, por lo tanto, su concentrado presenta mayor bromelina, acoplándose así de mejor manera a los sustratos, y en especial al jugo de carneItem Determinación de la de un concentrado que contiene papaína, obtenida de la papaya (Carica papaya), medida en soluciones proteínicas(Universidad Técnica de Ambato. Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos. Carrera de Ingeniería Bioquímica, 2012) Chimborazo López, Cristina Lorena; Alvarado, Juan de DiosLa Papaya (Carica papaya), es un árbol frutal de la familia de caricaceaes, cultivado en muchos países tropicales. En Ecuador ésta fruta es cultivada en Cantidades considerables, por sus características es usada a nivel industrial. En el presente trabajo se realizó la obtención del concentrado con papaína a partir de la pulpa de la fruta de papaya (Carica papaya); se trabajó con 4 papayas verdes en total y se ejecutó los análisis por duplicado, obteniéndose 8 muestras. Para la obtención del concentrado se efectuó el proceso de extracción utilizando el solvente orgánico etanol y cloruro de sodio por separado. Para el proceso de concentración las muestras se secaron en la estufa a 40°C por 48 horas y el polvo obtenido se almacenó a 5°C. Para verificar la funcionalidad del concentrado se cuantificó la actividad enzimática en dos sustratos proteínicos, solución de leche en polvo y en jugo de carne. Se pesó 15,5 g de leche en polvo y se mezcló con 108 ml de agua, por otro lado se disolvió en 100 ml de vinagre 0,1g de concentrado proteínico con papaína obtenido de cada solución extractora, luego se añadió 10 ml de la solución de vinagre en la solución de leche, las muestras se colocaron en un baño crioscópico y se tomó 10 ml de la solución final cada 2 minutos, se procedió a registrar los tiempos de escurrido de las muestras en el viscosímetro de Cannon – Fenske. Para la obtención del jugo de carne, ésta se trituró en un molino y se exprimió en un lienzo, el jugo de carne recolectado se filtró; el concentrado proteínico con papaína obtenido de cada solución previamente disuelto en vinagre se colocó en el líquido de la carne y se siguió el mismo procedimiento anterior para la determinación de la actividad enzimática. Se efectuó un análisis de regresión lineal a las respuestas experimentales y mediante el análisis estadístico se concluyó que el etanol permitió una extracción más eficaz en comparación con el cloruro de sodio, mientras que en el jugo de carne usado como sustrato se obtuvieron los mejores resultados. La metodología aplicada permitió la obtención de un concentrado con papaína a bajo costo y con un grado aceptable de actividad enzimática.Item Extracción, concentración y medida de la actividad enzimática de la ficina obtenida del Látex del Higo (ficus carica)(Universidad Técnica de Ambato. Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos. Carrera de Ingeniería Bioquímica, 2011) De La Cruz Guerrero, Cristina Elizabeth; Velasteguí Sánchez, José RamiroEn etapas de la vida en las que se produce un rápido crecimiento corporal y la demanda de nutrientes es mayor, se hace necesario optimizar la absorción de nutrientes a fin de evitar deficiencias. El ácido fítico (inositol fosfato) presente en cereales y otros granos puede inhibir de forma significativa la absorción de minerales mediante la formación de complejos insolubles con minerales, como el hierro no hemo, el calcio y el zinc; comprometiendo el desempeño de las proteínas. Por ello, es de gran importancia tratar de establecer los tratamientos tecnológicos necesarios para que la utilización de estos nutrientes esenciales sea al máximo. En la presente investigación, se determinó el contenido de ácido fítico en las siguientes líneas y/o variedades: chocho (Lupinus Mutabilis Sweet), quinua (Chenopodium quinua Willd), amaranto (Amaranthus Caudatus L.) y sangorache (Amaranthus Hybrydus L); que son granos de origen andino. Se comprobó que de las cuatro especies consideradas en este estudio el amaranto y el sangorache presentaron el mayor contenido de ácido fítico (1.25%) mientras que el chocho registró el menor contenido (1.10%). Se analizó los efectos de los tratamientos térmicos (cocción en agua, fritura, y tostado), comprobándose la efectividad del proceso de cocción en la disminución de ácido fítico, especialmente en el chocho y en menor grado en el sangorache. Contrariamente los procesos de tostado y la fritura del amaranto, quinua, sangorache y chocho produjeron un marcado incremento en el contenido de ácido fítico; con respecto al valor registrado en los granos crudos. El estudio de la biodisponibilidad de minerales se realizó con granos crudos y cocidos ya que en este proceso disminuyó sustancialmente el contenido de ácido fítico. La biodisponibilidad de los minerales se calculó a partir del porcentaje dializado tras la digestión in vitro de los granos cocidos y molidos. Los resultados revelaron que la biodisponibilidad del fósforo, hierro, y zinc son insignificantes con niveles de absorción entre 0% al 0.9%. Estos resultados hacen suponer que el ácido fítico no es el único antinutricional que compromete la disponibilidad de dichos minerales en los granos andinos en estudio. La biodisponibilidad del calcio también fue insignificante para la mayoría de los granos en estudio excepto la quinua que mostró una biodisponibilidad de 12.64%. Para los demás elementos se determinó adecuados niveles de biodisponibilidad; así para el potasio 34.79%, magnesio 41.19%, sodio 15.48%, cobre 51% y manganeso 16.13% en todas las líneas y/o variedades. Para la digestibilidad proteica se trabajó con una solución multienzimática este método se da a través de la simulación de un proceso digestivo con enzimas de origen animal, como son: Tripsina, Chymotripsina y Peptidasa Pancreática; revelando que el cocimiento contribuyó a mejorar la digestibilidad de la proteína en todas las especies en estudio; las líneas y/o variedades que presentan mayor digestibilidad proteica son las de chocho alcanzando valores del 90%. En el caso del amaranto, sangorache y quinua los valores de digestibilidad fluctuaron entre 77 y 84% el menor valor registrado fue para el sangorache ECU-0069 con 77,3% en estado crudo. Análogamente el mayor contenido de lisina disponible deja ver que de las especies estudiadas el chocho presentó mayor contenido de lisina disponible (1.19 gr/100 gr proteína), lo cual se correlaciona con el mayor contenido de proteína digerible tanto en el grano crudo como en el cocido. El sangorache presentó menor contenido de lisina disponible (0.47 gr/100 gr proteína). En general, el contenido de lisina disponible en los granos andinos estudiados es notable; en el caso del chocho, la quinua y el amaranto, superan el patrón de referencia establecido por la OMS/FAO ( 0.55g/100gr proteína).Item Extracción, concentración y cuantificación de la actividad enzimática de la bromelina a partir de la piña(Universidad Técnica de Ambato. Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos. Carrera de Ingeniería Bioquímica, 2011) Robayo Muñoz, Darío Francisco; Alvarado, Juan de DiosLa bromelina es una enzima purificada del fruto de la piña y consiste en una cisteína-proteinasa de naturaleza ácida perteneciente a la misma familia que la papaína, obtenida de la papaya o Carica papaya. La experiencia con enzima en el país esta despuntando y la bromelina, debido a sus diferentes usos, puede llegar a ser de gran importancia a nivel industrial. Para este estudio se trató de probar el efecto de 3 grados de maduración de la piña: verde, pintona y madura; y su efecto en la actividad enzimática de la enzima bromelina. Se trabajó con 10 piñas como base para cada grado de maduración de la fruta, repartidas en las 2 réplicas que se evaluaron, donde se trabajó con un total de tres tratamientos. Se seleccionó la fruta para los tres grados de maduración, en la extracción del jugo realizada por maceración del fruto de la piña en un mortero, luego se recolecta y se procede a secar en una incubadora a 30ºC durante 18±1 horas, dependiendo de la cantidad de jugo; de esta manera se logró concentrar la enzima y se la conservó en congelación. Para la evaluación de la actividad enzimática se utilizó determinaciones de viscosidad de la leche, obtenida por disolución de leche en polvo, añadida a ésta 10ml de una solución de 0,1g de la enzima disuelta en 100ml de ácido acético; con estos valores de viscosidad se realizaron curvas de tiempo (s) vs. viscosidad (mPa*s); en las que se realizó una regresión exponencial, obteniendo las respuestas experimentales que fueron los valores de corte con el eje y de éstas regresiones. Con el análisis estadístico se demostró que el mejor tratamiento es el T1 que corresponde a piñas verdes, es decir, que tiene mayor actividad enzimática con relación a los otros grados de madurez de piñas.