Desarrollo de técnicas de detección de Fusarium oxysporum f. sp. cubense raza 4 (R4T) utilizando tres pares de primer a través de (PCR) tiempo final
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Date
2024-08
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Abstract
Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4 (R4T) is a pathogen that specifically affects
Musaceae. This phytopathogenic agent causes the most devastating diseases of these crops
worldwide. Attacking several cultivars belonging to the Cavendish subgroup (AAA), they are
seriously affected by race 4, which currently represents the majority of world production and
export. The objective of this research was to “Develop detection techniques for Fusarium
oxysporum f. sp. cubense race 4 (R4T) using three pairs of primer through end-time (PCR). To
comply with this, the biomass is lyophilized, the DNA was extracted with the use of buffers
(Buffer A NaOH + Tween 20 and Buffer B Tris HCl + EDTA). It was subsequently centrifuged
and cleaned with absolute ethanol, and stored at -20°C. For amplification using conventional
PCR, different programs were established according to the primer sets used. 4 µl of the
Mastermix solution was used for each reaction, sets of primers (Forward-reverse), ultrapure
water, to complete a final reaction volume of 54 µl. For visualization of the gels, 1.5% agarose
was used with the following sets of primer W2987-F; W2987-R and FocTR4-F; FocTR4-R and
1% agarose with the primer EF1 and EF2 and the 1X TAE running buffer, using 2 µl of the
SYBR safe intercalating agent to be able to observe the Invitrogen DNA bands. Finally,
molecular markers (Tracklt TM 50bp and 100 bp Invitrogen) were used to determine the size of
the bands. The results were the presence of a DNA band with the first W2987-F; W2987-R and
FocTR4-F; FocTR4-R, the molecular weight marker (Tracklt TM 50bp Invitrogen) was used at
1.5% agarose, at a hybridization temperature (annealing) of 60 °C, bands of approximately 452
and 463 were visualized, with the primer EF1 and EF2. R the molecular marker (Tracklt TM
100bp Invitrogen) was used in 1% agarose, at a hybridization temperature (annealing) of 60 °C
a band of approximately 700bp was visualized.
Description
Fusarium oxysporum f. sp. cubense raza 4 (R4T) es un patógeno que afecta
específicamente a las musáceas. Este agente fitopatógeno causa las enfermedades más
devastadoras de estos cultivos a nivel mundial. Atacando varios cultivares pertenecientes al
subgrupo Cavendish (AAA), son seriamente afectadas por la raza 4 quienes representa a la
mayoría de la producción y exportación mundial en la actualidad. Para la presente investigación
se tuvo como objetivo “Desarrollar técnicas de detección de Fusarium oxysporum f. sp. cubense
raza 4 (R4T) utilizando tres pares de primer a través de (PCR) tiempo final”. Para dar
cumplimiento al mismo, se liofiliza la biomasa, se extrajo el ADN con el uso de los tampones
(Tampón A NaOH + Tween 20 y Tampón B Tris HCl + EDTA). Posteriormente se centrífugo
y se limpió con etanol. Se conservó a -20°C. Para la amplificación mediante el PCR
convencional se establecieron diferentes programas acordes con los juegos de primer usados.
Se utilizó 4 µl de la solución Mastermix por cada reacción, juegos de primers (Foward- reverse),
agua ultra pura, para completar un volumen de reacción final de 54 µl. Para la visualización de
los geles se utilizó agarosa al 1.5% con los siguientes juegos primer (W2987-F; W2987-R y
FocTR4-F; FocTR4-R) y al 1% de agarosa con el juego de primer EF1 - EF2 y el buffer de
corrida TAE 1X, utilizando 2 µl el agente intercalante SYBR safe para poder observar las
bandas de ADN de Invitrogen. Por último, se utilizó los marcadores moleculares (Tracklt TM
50bp y 100 pb Invitrogen), para determinar el tamaño de las bandas. Teniendo como resultados
la presencia de banda de ADN con el primer W2987-F ; W2987-R y FocTR4-F ; FocTR4-R
se utilizó el marcador de peso molecular de (Tracklt TM 50bp Invitrogen) al 1.5% de agarosa, a
una temperatura de hibridación (annealing) 60 °C, se visualizó bandas de 452 y 463
aproximadamente, con el primer EF1 y EF2 R se utilizó el marcador molecular de (Tracklt TM
100 bp Invitrogen) al 1% de agarosa, a una temperatura de hibridación (annealing) 60 °C se
visualizó una banda de 700bp aproximadamente.
Keywords
AGRONOMÍA, DE Fusarium oxysporum f. sp. cubense raza 4, CUBENSE RAZA 4, MUSÁCEAS, PRIMERS, PCR, ANNEALING, Fusarium oxysporum