Caracterización cinética de las variantes silvestre y mutantes I208V, N212A y S238Y de la enzima PETasa de Ideonella sakaiensis
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Date
2024-08
Authors
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Publisher
Universidad Técnica de Ambato. Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos y Biotecnología. Carrera de Biotecnología
Abstract
The accumulation of plastic waste has reached critical levels, with 8 million tons polluting the oceans annually. The resulting microplastics enter ecosystems and organisms, posing a serious threat to environmental health. In response, bioremediation has emerged as a sustainable alternative, employing microorganisms or enzymes to degrade polymers. The enzyme IsPETase from Ideonella sakaiensis is particularly more effective than other PET-degrading enzymes. Thus, mutations close to the active site (S238Y, N212A and I208V) have been recently designed to improve its activity and thermostability, evaluated in qualitative analyses. Therefore, in this research the kinetics of these mutants was characterized by evaluating the kinetic parameters of the reactions catalyzed by these enzymes, using p(NP)-acetate as substrate and varying the temperature (25, 35 and 45 degrees Celsius). The data were analyzed with GraphPad Prism. A reduction in KM was observed in the mutants, indicating that the mutations increased the affinity for the substrate, although the decrease in kcat, reflected a lower catalytic capacity, especially for the I208V variant. Overall, all three mutations are less efficient than the WT variant in hydrolyzing phenyl esters under saturated conditions. Regarding the effect of temperature, the N212A variant showed the highest activity at 45 degrees Celsius, standing out as the most thermostable. This study aims to deepen the catalytic efficiency of IsPETase mutants, contributing to the development of biotechnological recycling for plastic wastes.
Description
La acumulación de residuos plásticos ha alcanzado niveles críticos, con 8 millones de toneladas contaminando los océanos anualmente. Los microplásticos resultantes penetran en ecosistemas y organismos, representando una grave amenaza para la salud ambiental. En respuesta, la biorremediación surge como una alternativa sostenible, empleando microorganismos o enzimas para degradar polímeros. La enzima IsPETasa de Ideonella sakaiensis es particularmente más efectiva que otras enzimas degradadoras de PET. De modo que, recientemente se han diseñado mutaciones cercanas al sitio activo (S238Y, N212A e I208V) para mejorar su actividad y termoestabilidad, evaluadas en análisis cualitativos. Por lo que en esta investigación se caracterizó la cinética de estas mutantes mediante la evaluación de los parámetros cinéticos de las reacciones catalizadas por estas enzimas, utilizando p(NP)-acetato como sustrato y variando la temperatura (25, 35 y 45 grados Centígrados). Los datos fueron analizados con GraphPad Prism. Se observó una reducción en la KM en las mutantes, lo que indicó que las mutaciones aumentaron la afinidad por el sustrato, aunque la disminución en la kcat reflejó una menor capacidad catalítica, especialmente para la variante I208V. En términos globales, las tres mutaciones son menos eficientes que la variante WT para hidrolizar fenil ésteres en condiciones de saturación. En cuanto al efecto de la temperatura, la variante N212A mostró la mayor actividad a 45 grados Centígrados, destacándose como la más termoestable. Este estudio busca profundizar en la eficiencia catalítica de las mutantes de IsPETasa, contribuyendo al desarrollo de reciclaje biotecnológico para desechos plásticos.
Keywords
GESTIÓN AMBIENTAL, GESTIÓN DE RESIDUOS, BIODEGRADACIÓN, CINÉTICA ENZIMÁTICA, MUTAGÉNESIS DIRIGIDA, POLIETILENO TEREFTALATO (PET), IDEONELLA SAKAIENSIS