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Título : Diseño y validación in silico de primers para la construcción de las variantes mutantes S121E, S121D, D186H y R280A de la enzima PETasa de Ideonella sakaiensis mediante tres diferentes métodos de mutagénesis dirigida al sitio
Autor : Cerda Mejía, Liliana Alexandra
Herrera Aldaz, Bryan Alexander
Palabras clave : BIOINFORMÁTICA
DISEÑO DE PRIMERS
GESTIÓN DE RESIDUOS
MUTAGÉNESIS DIRIGIDA
PETASA
IDEONELLA SAKAIENSIS
Fecha de publicación : mar-2022
Editorial : Universidad Técnica de Ambato. Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos y Biotecnología. Carrera de Ingeniería Bioquímica
Resumen : The PETase enzyme from Ideonella sakaiensis (IsPETase) can be used to degrade PET, however, although it has been reported to date to have the highest enzymatic activity under normal conditions of all PET degrading enzymes, its low thermal stability limits its analysis and application. Therefore, by targeted mutagenesis, specific mutations can be introduced into the DNA to significantly increase its enzymatic activity. The purpose of this study was the design and in silico validation of primers for the construction of S121E, S121D, D186H and R280A mutant variants of IsPETase using three site-directed mutagenesis techniques: QuikChange, Q5 Site-Directed Mutagenesis and Phusion Site-Directed Mutagenesis. For the design of the primers, the parameters contained in the design guidelines for targeted mutagenesis methods were considered. The results showed that the 24 primers obtained meet the general criteria such as length, melting temperature, percentage of GC content and the position of the mutation in the primer. For the validation of the proposed primers, hairpin, autodimer and heterodimer analysis was performed with bioinformatics tools, the calculated values are within acceptable ranges. Finally, the specificity of the primers design was carried out by means of alignments, whose results indicate a high specificity for their respective targets. Likewise, an in silico PCR assay confirmed the specificity of the primers, which represent the expected amplification product, thus demonstrating the correct selection of the designed primers and the execution of the mutagenic PCR process.
Descripción : La enzima PETasa de Ideonella sakaiensis (IsPETasa) puede utilizarse para degradar el PET, sin embargo, aunque se ha informado hasta la fecha que posee la mayor actividad enzimática en condiciones normales de todas las enzimas degradantes de PET, su baja estabilidad térmica limita su análisis y aplicación. Por lo que, mediante mutagénesis dirigida se puede introducir mutaciones específicas en el ADN para incrementar significativamente su actividad enzimática. La finalidad de este estudio fue el diseño y validación in silico de primers para la construcción de las variantes mutantes S121E, S121D, D186H y R280A de IsPETasa mediante tres técnicas de mutagénesis dirigida al sitio: Quik Change, Q5Site-Directed Mutagenesis y Phusion Site-Directed Mutagenesis. Para el diseño de los primers, se consideró los parámetros contenidos en las directrices de diseño de los métodos de mutagénesis dirigida. Los resultados mostraron que los 24 primers obtenidos cumplen con los criterios generales como longitud, temperatura de melting, porcentaje de contenido de GC y la posición de la mutación en el primer. Para la validación de los primers propuestos, se realizó un análisis de horquillas, autodímeros y heterodímeros con herramientas bioinformáticas, los valores calculados se encuentran dentro de rangos aceptables. Finalmente, la especificidad del diseño de los primers se llevó a cabo mediante alineamientos, cuyos resultados indican una alta especificidad para sus respectivos objetivos. Así mismo, mediante un ensayo in silico de PCR se confirmó la especificidad de los primers, los cuales representan el producto de amplificación esperado, demostrando de esta manera la correcta selección de los primers diseñados y la ejecución del proceso de PCR mutagénica.
URI : https://repositorio.uta.edu.ec/jspui/handle/123456789/34971
Aparece en las colecciones: Carrera Ingeniería Bioquímica

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